树突状细胞（DCs）概述及体外诱导培养（下篇）

938 人阅读发布时间：2023-04-04 18:09

一、从人外周血单核细胞诱导DCs（最常用方法）

1. 无菌条件下用密度梯度离心法从全血中获得人外周血单个核细胞（PBMCs）（如Ficoll-Hypaque）。

2. 磁珠分选法获得单核细胞：使用人单核细胞富集试剂盒（如EasySep（反选）或 CD14 MicroBeads（正选））富集获得单核细胞。富集得到的单核细胞可通过流式细胞术（CD3、CD14、CD19）检测其纯度。

3. 用培养基RPMI 1640（含10%FBS）调整富集的单核细胞浓度至5×10⁵ cells/mL，铺于24孔板上，同时加入重组人IL-4（500 U/ml）和GM-CSF（500 U/ml），37℃，5%CO₂培养箱中孵育。

4. 48h后，培养板中培养基进行半量换液，同时补充重组人IL-4（500 U/ml）和GM-CSF（500 U/ml），继续刺激2天。

5. 第5天，收获未成熟的树突细胞，即单核细胞来源树突状细胞（monocyte-Derived dendritic cells， MoDCs），用于下游实验。吸取培养板中细胞转移至离心管，对细胞进行计数，并用细胞活力染料和CD3（T细胞marker）, CD14（单核细胞 marker）和CD209（MoDCs marker）的抗体对获得的MoDCs样品进行染色，检测其活性及分化情况。

6. 成熟DCs激活：为获得完全成熟的DCs，通常可使用LPS或TNF-alpha/IL-6/IL-1β/PGE2进一步刺激上述细胞，具体方案：用LPS（0.5 μg/ml）或 TNF-alpha（10ng/ml）、IL-6（10ng/ml）、IL-1β（10ng/ml）、PGE2（1μmol/l）刺激24-48h。之后可使用流式细胞术（CD80、CD86）检测DCs成熟情况。

二、从人脐带血CD34⁺造血前体细胞诱导DCs

1. 获得新鲜脐带血，无菌条件下通过Ficoll-Hypaque梯度离心获得脐血单核细胞（CBMCs）。
（CBMCs可用7.5%DMSO，50%FBS冻存，用于后续实验。复苏时，37℃快速解冻，加入DNase I的培养基，室温离心15min。）

2. CD34+造血前体细胞获得及培养：使用商业化磁珠分选试剂盒如 EasySep™ Human CD34 Positive selection kit分选获得CD34+前体细胞。CD34+前体细胞用RPMI 1640 培养基（含10% FBS, 2 mM L-glutamine, 5×10^-5 M 2-mercaptoethanol, penicillin （100 U/ml）及streptomycin（100 ng/ml））调整细胞浓度至1×10⁵cells/mL，铺于24孔板上，并加入重组人GM-CSF（20 ng/ml）、IL-4（20 ng/ml）,、TNF-α（20 ng/ml）、SCF（100 ng/ml）、Flt3 ligand（100ng/ml）或GM-CSF（20 ng/ml）、TNF-α（20 ng/ml），37℃，5% CO₂培养箱中培养，每周2次采用半量换液，补加新鲜培养基及细胞因子，持续培养14天。

3. 14天后，收获未成熟树突细胞，即脐血来源树突状细胞（cord blood mononuclear cells，CBDCs）。吸取培养板中细胞，转移至离心管，对细胞进行计数，并用细胞活力染料和CD1a、CD14、CD33、CD34抗体对获得的CBDCs细胞样品进行染色，检测其活性及分化情况。

4. 成熟DCs激活：为获得完全成熟的DCs，通常可使用PolyI:C或LPS进一步刺激上述细胞，具体方案：用PolyI:C（10 μg/ml）或LPS（100–500 ng/ml）刺激24h。之后可使用流式细胞术（CD1a、CD14、 CD33、 CD34、HLADR、CD40、 CD80、CD86）检测DCs成熟情况。

*以上方案供参考，根据实验情况进行适当调整优化。

Fig. DC life cycle. Immature myeloid DCs can differentiate from CD34 + stem cells cultured with GM-CSF and TNF-α, or CD14 + monocytes cultured by GM-CSF and IL-4.
（From Histol Histopathol. 2004 Jan;19（1）:317-24.）

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