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关于人间充质干细胞hMSC的成脂分化
人阅读 发布时间：2024-03-25 10:19
人脂肪组织来源MSCs的分离
1. 将1g的脂肪组织放入含有10 mL消化液（II型胶原酶+嗜热菌蛋白酶）的50 ml试管中，37°C，温和搅拌，孵育2h。
2. 加入30 mL DMEM培养基（含10%胎牛血清），终止消化。
3. 300g，室温离心10 min。
4. 弃上清，加入30 mL DMEM培养基(含10%胎牛血清），重悬细胞沉淀。
5. 300g，室温离心10 min。
6. 弃上清，加入10 mL DMEM培养基(含10%胎牛血清），重悬细胞沉淀。将重悬细胞加入培养皿进行培养，同时添加青霉素-链霉素。
（以上操作参见Abiel公司“MSCs FROM ADIPOSE TISSUE - ISOLATION KIT”操作流程）
人MSCs的成脂分化
基于对不同类型培养基的比较研究，这里推荐使用α-MEM基础培养基；然而，DMEM/F12和F12基础培养基也有证实适合成脂分化。
成脂诱导培养基的配制：100 mL的生长培养基中，添加终浓度0.1 μM 地塞米松、0.45mM IBMX，1 μg/mL胰岛素和0.2mM 吲哚美辛。无菌过滤，4℃存储，最长不超过3周。如果需要，可以在使用诱导培养基中添加终浓度1 μM罗格列酮。培养基中加入罗格列酮后，4°C保存，仅可保存1-2天。
*这里采用的胰岛素的浓度比许多其他方案中低10倍。2001年Janderova等人的一项研究比较了诱导培养基中胰岛素的浓度与干细胞的成脂转化率，发现这种低浓度的胰岛素即可。当然，具体应用中可根据实验情况进行调节。
*使用罗格列酮并不是脂肪形成的先决条件。然而，当加入罗格列酮时，成脂分化的速度略快（快2-3天）。
4. 加入5-10 mL的生长培养基终止消化，并重悬细胞。
*细胞计数：台盼蓝染色计数，活细胞数量应大于98%。
7. 置于37°C，5% CO2培养箱中培养10-21天，每2-3天换液。培养期间，通过显微镜观察细胞内脂滴形成情况来调整诱导分化时间。
*不同来源MSC细胞成脂时间会有所不同。
参考文献：
产品推荐：
1. 将1g的脂肪组织放入含有10 mL消化液（II型胶原酶+嗜热菌蛋白酶）的50 ml试管中，37°C，温和搅拌，孵育2h。
2. 加入30 mL DMEM培养基（含10%胎牛血清），终止消化。
3. 300g，室温离心10 min。
4. 弃上清，加入30 mL DMEM培养基(含10%胎牛血清），重悬细胞沉淀。
5. 300g，室温离心10 min。
6. 弃上清，加入10 mL DMEM培养基(含10%胎牛血清），重悬细胞沉淀。将重悬细胞加入培养皿进行培养，同时添加青霉素-链霉素。
（以上操作参见Abiel公司“MSCs FROM ADIPOSE TISSUE - ISOLATION KIT”操作流程）
人MSCs的成脂分化
1.试剂准备：
生长培养基配制：α-MEM基础培养基中添加10%胎牛血清、青霉素（100 U/mL）、链霉素（100 μg/mL）。基于对不同类型培养基的比较研究，这里推荐使用α-MEM基础培养基；然而，DMEM/F12和F12基础培养基也有证实适合成脂分化。
成脂诱导培养基的配制：100 mL的生长培养基中，添加终浓度0.1 μM 地塞米松、0.45mM IBMX，1 μg/mL胰岛素和0.2mM 吲哚美辛。无菌过滤，4℃存储，最长不超过3周。如果需要，可以在使用诱导培养基中添加终浓度1 μM罗格列酮。培养基中加入罗格列酮后，4°C保存，仅可保存1-2天。
*这里采用的胰岛素的浓度比许多其他方案中低10倍。2001年Janderova等人的一项研究比较了诱导培养基中胰岛素的浓度与干细胞的成脂转化率，发现这种低浓度的胰岛素即可。当然，具体应用中可根据实验情况进行调节。
*使用罗格列酮并不是脂肪形成的先决条件。然而，当加入罗格列酮时，成脂分化的速度略快（快2-3天）。
2.取之前分离获得的MSC细胞，去除培养基，用PBS洗涤细胞两次。
3. 加入胰蛋白酶/EDTA，37℃ 孵育2min。（显微镜下观察消化情况，如果2min细胞还未分离，可适当延长消化时间。）4. 加入5-10 mL的生长培养基终止消化，并重悬细胞。
*细胞计数：台盼蓝染色计数，活细胞数量应大于98%。
5.加入适量生长培养基，调节细胞浓度至30,000 cells/mL，铺板至24孔板，每孔0.5mL。置于37℃，5% CO2培养箱中培养24h-48h，至细胞融合度达到80-90%。
6. 更换为成脂诱导培养基，每孔0.5mL。7. 置于37°C，5% CO2培养箱中培养10-21天，每2-3天换液。培养期间，通过显微镜观察细胞内脂滴形成情况来调整诱导分化时间。
*不同来源MSC细胞成脂时间会有所不同。
8.脂肪细胞形成后通过油红O染色进行组织学分析或RT-PCR检测脂肪形成标志物如PPAR-γ、C/EBPα 、aP2、FABP4等的表达情况。
参考文献：
· Alonso-Pérez A, Guillán-Fresco M, Franco-Trepat E, etc. Improved Protocol to Study Osteoblast and Adipocyte Differentiation Balance. Biomedicines. 2023 Jan; 11(1): 31.
· Fink T, Zachar V. Adipogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. Methods Mol Biol. 2011:698:243-51.
· Janderova, L., McNeil M., Murrell A. N., etc. Human mesenchymal stem cells as an in vitro model for human adipogenesis., Obes Res. 2003 Jan;11(1):65-74. 65–74.
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