B细胞的活化及体外扩增培养

B细胞即B淋巴细胞，是适应性免疫反应中三种类型的淋巴细胞之一，其他两种是T细胞和自然杀伤（NK）细胞。B细胞来源于骨髓的多能干细胞。B细胞参与体液免疫，其功能是产生抗体，递呈抗原，以及分泌细胞内因子参与免疫调节。

 

B细胞分多种类型，常规B细胞又叫B2细胞。成熟初始B细胞接受抗原刺激后，在抗原呈递细胞(antigen presenting cells, APC)和辅助性T细胞(helper T cell, Th)的辅助下成为活化B细胞，进而分化为浆细胞(plasma cell , PC)，合成和分泌各类免疫球蛋白即抗体，以应对外来病原体的入侵。B细胞被激活后除分化为浆细胞外，其余则分化为记忆B细胞(memory B cell)。记忆B细胞被保留在淋巴系统的生发中心，用于防御免疫系统再次遇到特定抗原的情况。记忆B细胞通常可存活数年，甚至终生。当机体再次受到同种抗原攻击时，滤泡辅助T细胞会使记忆B细胞迅速活化、增殖、分化，形成大量浆细胞以清除抗原。这一过程使免疫系统比以前更快、更有力地反应。    

 

Fig 1. The developmental of mature B cells.( From Front. Immunol., 07 June 2021)

 

B细胞可以通过表面标记物如CD19和CD20进行鉴定（浆细胞除外，浆细胞可通过表面标志物CD27++和CD38++以及转录因子BLIMP1、XBP1和IRF4的表达来鉴别。此外，浆细胞表达高水平的CD138）。

 

B细胞的活化和培养

 

在没有刺激的情况下，B细胞一般不会增殖。在培养条件下并给予外源信号，B细胞能够活化并且增殖。B细胞被激活的方式有两种，分别是T细胞依赖型和非T细胞依赖型。 这两种不同的激活方式都需要两种信号，BCRs与抗原表位交联可以提供一种信号，该信号可用抗IgM或IgD抗体来模拟。T细胞依赖型激活的第二信号是共刺激信号（常由CD40与CD40L的直接结合而提供），非T细胞依赖型激活的第二信号是明确的危险信号。

 

Fig 2. B-cell activation(From Technology Networks)

 

体外培养和扩增B细胞的能力已成为研究人类免疫的有用工具。目前人类B细胞培养方法的一个局限性是支持成熟B细胞增殖的能力。Kuei-Ying Su等人提出了一种高效体外培养人初始B细胞的方法，供参考。

1. 单核细胞获取：从健康的成年捐献者采集血液样本，使用SepMate-50试管（STEMCELL Technologies）通过Ficoll-paque plus（GE）密度梯度离心分离单核细胞。细胞在液氮中冷冻保存直至使用。对于微生物抗原特异性T细胞研究，在破伤风白喉加强针和/或流感疫苗接种后2至5周收集血液样本。

2. 成熟初始B细胞分离：采用商业化EasySep人初始B细胞富集试剂盒（STEMCELL Technologies）通过阴性选择从PBMC中分离出人成熟初始B细胞。流式细胞术鉴定成熟初始B细胞（CD19+CD27-IgM+IgD+）的纯度>94%。

3. B细胞培养：将人B细胞(1~6×10³) 接种在6孔板或10cm的组织培养皿中，细胞密度控制在 ~100个B细胞/cm²。这些培养板或培养皿预先用表达CD154的基质细胞（CD40L^low细胞系）接种过夜。B细胞采用R5培养基进行培养，并加入重组人IL-2（50 ng/ml）、IL-4（10 ng/ml）、IL-21（10 ng/ml）和 BAFF (10 ng/ml)。6孔板的每孔培养基添加量为2ml，10cm培养皿每皿为6 ml。在培养第4天和第6天，半量换液，用预热的含有细胞因子的新鲜R5培养基替换。一般共培养8 天。在培养结束时，收获CD B（Culture-derived (CD) B cells）细胞，计数，等分，并在液氮中冷冻保存直至使用。在一些实验中，如果需要培养超过8天时，在第8天将细胞转移到新饲养层细胞上。

*R5培养基：RPMI 1640中加入5% 人血清、55 µM β-ME、2 mM L-谷氨酰胺、100 U/ml 青霉素、100 µg/ml 链霉素、10 mM HEPES、1 mM 丙酮酸钠和 1% MEM 非必需氨基酸。

 

文献参考

l B Cells, Memory B Cells and Plasma Cells: B Cell Activation, Development and the B Cell Receptor.Technology Networks Immunology & Microbiology.Published: March 19, 2024.

l B Cell Metabolism and Autophagy in Autoimmunity. Front Immunol. 2021 Jun 7:12:681105.

l Efficient Culture of Human Naïve and Memory B cells for Use as Antigen-presenting Cells. J Immunol. 2016 Nov 15;197(10):4163-4176.

 

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