小鼠骨髓来源嗜酸性粒细胞培养方案

背景介绍

白细胞有三种类型，包括粒细胞、淋巴细胞和单核细胞，它们都具有帮助免疫系统的各种功能。嗜酸性粒细胞（Eosinophils, EOS）是三种粒细胞之一，与中性粒细胞和嗜碱性粒细胞并列。

 

嗜酸性粒细胞的细胞质中含有嗜酸性颗粒，能够被酸性染料（如伊红）染色。细胞核分叶，多以两个不分段的裂片存在。用瑞氏染料染色后，嗜酸性粒细胞的颗粒通常呈砖红色或鲜红色，细胞核呈深紫色，这使得它们在显微镜下观察时很容易与其他粒细胞区分开来。

 

嗜酸性粒细胞占体内所有白细胞的不到5%。嗜酸性粒细胞可以保护机体免受寄生虫、过敏原、外来细菌和外部生物的侵害。

 

图   白细胞分类及功能(源自ar.inspiredpencil.com)

 

 

骨髓来源的嗜酸性粒细胞培养流程

1. 小鼠骨髓细胞的获得

1.1 小鼠(6~8周)颈椎脱臼法处死，将处死的小鼠放于含有酒精的小烧杯中浸泡2 min，消毒灭菌，在超净台中手术取出所有的胫骨和股骨，并用剪刀和镊子将骨周围的肌肉组织尽量去除干净。

注：6-8周龄的小鼠将产生最高产量的低密度骨髓部分。

1.2 将取好的骨头转移到装有无菌PBS的培养皿中，涮洗一次后转移至另一个装有无菌PBS的培养皿。

1.3 用剪刀剪去骨的两端，再用注射器抽取PBS，针头分别插入两端骨髓腔中，用注射器打入PBS，反复冲洗骨髓至培养皿中，直至骨完全变白。

1.4 收集骨髓悬液，用筛网过滤去除小碎片和肌肉组织。

1.5 将滤过液4℃，500×g，离心5 min，弃去上清。

1.6 将离心后的沉淀弹散，加入2 ml红细胞裂解液(1X)，室温裂解5 min。

1.7 加4ml PBS终止裂红，4℃，500×g，离心5 min，弃去上清。

1.8 加入3ml PBS重悬细胞沉淀。

1.9 取3ml Histopaque®-1083加入15ml离心管，轻轻将上一步细胞悬液铺在Histopaque®-1083上。在该步骤结束时，应该有两层：底部透明层包含Histopaque®-1083，顶部浑浊层包含细胞。

注：在Histopaque-1083上添加细胞必须非常缓慢，一滴一滴地进行，以避免混合。

1.10 室温下400×g，离心30 min。

1.11轻轻收集中间层细胞，用10ml PBS重悬，4℃，500×g，离心5 min，弃去上清。

 

2. 小鼠嗜酸性粒细胞培养

2.1用IMDM培养基（含Glutamax-1 with 10% FBS, 100 U/ml penicillin,100 μg/ml streptomycin）重悬细胞至1*10^6/ml，并加入终浓度为100 ng/ml的mouse SCF和 100 ng/ml mouse FLT3-Ligand。24孔培养板中加入1ml细胞悬液，此后隔天半量换液。

注：因为生长成嗜酸性粒细胞的细胞不是粘附性的，因此必须非常小心地更换培养基，以避免细胞与旧培养基一起被清除。

2.2 培养第4天，收集细胞，4℃，500×g ，离心5 min，用IMDM培养基（含Glutamax-1 with 10% FBS, 100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin）重悬细胞至1*10^6/ml，并加入终浓度为10 ng/ml的mouse IL-5。24孔培养板中加入1ml细胞悬液，此后隔天半量换液。

2.3 培养至第14天，收集成熟细胞，进行细胞鉴定。如用瑞氏染色进行细胞形态观察或通过流式细胞术检测嗜酸性粒细胞表面标志物（如CCR3, Siglec-F）的表达情况等。

 

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参考文献

· Bone Marrow Derived Eosinophil Cultures. Bio Protoc. 2014 Jun 20;4(12):e1161.

· Mouse Eosinophils: Identification, Isolation, and Functional Analysis. Curr Protoc Immunol. 2017 Nov 1:119:14.43.1-14.43.22.

· Functionally competent eosinophils differentiated ex vivo in high purity from normal mouse bone marrow. J Immunol. 2008 Sep 15;181(6):4004-9.