如何用Matrix Gel/基质胶培养小鼠小肠类器官？

类器官是简化的三维（3D）器官模拟体，作为新一代体外医学研究模型，广泛应用于基础生物学、疾病建模、药物开发及再生医学领域。干细胞与祖细胞通过自组织及其分化后代形成类器官。得益于肠道上皮的快速自我更新能力，肠道类器官成为体外治疗研究中最常用的类器官类型。位于肠道隐窝底部的干细胞可通过增殖分化为肠上皮细胞、杯状细胞、潘氏细胞及肠内分泌细胞，这些细胞是肠道类器官发育的关键。成功的体外类器官培养需依赖能精准模拟天然细胞外基质理化特性的3D基质。

Matrix Gel是小鼠肉瘤组织中提取的可溶性基底膜，包含层粘连蛋白（糖蛋白）、IV型胶原、巢蛋白（糖蛋白）、基底膜蛋白聚糖（硫酸乙酰肝素蛋白聚糖）等多种细胞外基质蛋白及必需生长因子。Matrix Gel专为支持类器官生长与分化优化开发，每批次产品均通过质控检测，可形成类器官培养体系中常规应用的稳定三维穹顶结构。

本指南验证了Matrix Gel在IntestiCult™类器官生长培养基（小鼠）（STEMCELL Technologies）中支持小鼠肠道类器官连续传代超过七次的能力。培养的类器官呈现典型出芽形态，且分化细胞表达特异性表面标志物。

 

操作指南

A.a. Matrix Gel的通用操作规范

按需从-20/-80℃解冻分装的Matrix Gel。所有操作需在冰上进行，并使用预冷的枪头与离心管。通过分装为一次性使用的小份以减少冻融次数。注意：所有接触Matrix Gel的耗材或培养基需预冷至冰上温度，解冻的 Matrix Gel将在10℃以上的温度下快速固化。

A.b. 关键材料与试剂

产品名称	供应商	产品编号 #
Matrix Gel	Chamot Biotechnology	CM003-10CO
IntestiCult Organoid™ 培养基(小鼠)	STEMCELL Technologies	06005
温和细胞解离液	STEMCELL Technologies	100-0485
DMEM/F-12（HEPES）	Thermo Fisher Scientific	11330032
牛血清白蛋白（BSA）	Thermo Fisher Scientific	B14
庆大霉素	Thermo Fisher Scientific	15750060
70 μm 过滤网	STEMCELL Technologies	27260
DPBS
组织培养板/瓶
50/15 mL离心管

B.a. 从小鼠新鲜小肠获取肠道隐窝

1. 冰上解冻1管 Matrix Gel。

2. 将24孔组织培养板置于37℃培养箱预热至少30分钟。

3. 依据IACUC规范处死小鼠，截取约20 cm小肠。

4. 将小肠置于含5 mL预冷（2-8℃）DPBS的10 cm培养皿中。

5. 吸取1 mL预冷（2-8℃）DPBS，将枪头从小肠一端伸入肠腔，冲洗肠腔。

6. 用手术剪纵向剪开小肠，用1 mL预冷（2-8℃）DPBS轻柔冲洗内肠壁3次。

7. 将小肠转移至含15 mL预冷（2-8℃）DPBS的10cm洁净培养皿中，用镊子夹持肠段充分漂洗。

8. 将肠段剪成2 mm片段，收集至含15 mL预冷（2-8℃）DPBS的50 mL离心管中。

9. 用预冷（2-8℃）DPBS预湿后的10 mL移液管上下吹打洗涤肠片段。静置离心管30秒，待小肠片段沉降后吸出上清弃置。重新加入15 mL预冷（2-8℃）DPBS。重复15-20次至上清澄清。

10. 去除上清，重悬肠片段于25 mL室温（15-25℃）温和细胞解离试剂中，室温（15-25℃）摇床孵育15分钟（20 rpm）。

11. 弃上清，重悬于10 mL预冷（2-8℃）DPBS（含0.1% BSA）中，上下吹打三次。

12. 让大部分肠片段沉降至底部。移除上清液，将剩余悬液通过70 µm滤网过滤至50 mL离心管中。标记滤液为“组分 1”并置于冰上。

13. 重复步骤11-12三次，得到组分 2至组分 4。

14. 将各组分在290 × g下离心5分钟，温度保持在2-8℃。小心弃去上清。

15. 将每个组分分别重悬于10 mL预冷（2-8℃）的DPBS + 0.1% BSA中。

16. 将每个悬液转移至标记有对应组分编号的新鲜15 mL离心管中。

17. 将各组分在200 × g下离心3分钟，温度保持在2-8℃。小心弃去上清。

18. 将每个隐窝组分分别重悬于10 mL预冷（2-8℃）的DMEM/F-12（含15 mM HEPES）中。

19. 从每个组分悬液中各取1 mL加入6孔板的单个孔中，使用倒置显微镜评估悬液质量。选择富含肠道隐窝的悬液。

注：适合培养的隐窝大小不一，通常类似于单层上皮细胞的小折叠片段。组分3和4通常富含理想的隐窝。

20. 对于选定的组分，使用倒置显微镜计数10 μL等分样品中的隐窝数量，并计算每毫升悬液中的隐窝数量。

21. 从选定的组分中，将含有约2000个隐窝的悬液分装至15 mL离心管中。

后续步骤请参考C部分进行肠道类器官培养。

B.b.复苏小鼠肠道类器官

1. 冰上解冻1管Matrix Gel。

2. 将24孔组织培养板在37℃培养箱中预热30分钟。

3. 将含有类器官的冷冻管置于37℃水浴中解冻。通常需要不到3分钟。待冷冻培养基完全液化且类器官可见后立即进行后续步骤。

4. 将冷冻管中的内容物转移至15 mL离心管中，并加入9 mL DMEM/F-12（含15 mM HEPES + 1% BSA）。使用移液管轻柔吹打5次以重悬类器官。

5. 使用倒置显微镜计数类器官数量，计算每毫升悬液中的类器官数量，并将含有约2000个类器官的悬液分装至另一个15 mL离心管中。

后续步骤请参考C部分进行肠道类器官培养。

C. 小鼠小肠类器官培养

1. 将来自B.a.或B.b.步骤的类器官等分样品在200 × g下离心5分钟，温度保持在2-8℃。弃置上清。

2. 向类器官沉淀中加入90 µL室温的完全类器官生长培养基（小鼠）。

3. 加入210 µL Matrix Gel，轻柔吹打10次以重悬沉淀。避免引入气泡。

4. 将悬液小心加入预热的24孔板的5个孔中，每孔50 µL。将移液枪头保持在孔板底部上方，并缓慢释放。样品应在每孔中央形成穹顶结构。避免引入气泡。

5. 将孔板转移至37℃培养箱中孵育10-15分钟，直至Matrix Gel固化。转移过程中请勿扰动穹顶结构。

6. 沿孔壁缓慢加入750 µL室温（15-25℃）的完整类器官生长培养基（小鼠）。请勿直接将培养基滴加在凝胶穹顶上。

7. 向未使用的孔中加入无菌DPBS。

8. 盖上孔板盖，置于37℃、5% CO₂的培养箱中培养。

9. 每3天更换一次培养基，使用750 µL新鲜的完整类器官生长培养基（小鼠），室温（15-25℃）操作。使用Nikon C2共聚焦显微镜观察类器官的发育情况（图1）。小鼠肠道类器官应每7-9天传代一次，平均传代比例为1:5。

注1：新鲜分离的小肠隐窝通常在培养2-4天后开始出芽。

注2：对于从冷冻管复苏的类器官，建议在用于下游实验前传代2次以获得最佳结果。类器官生长初期较慢，1-2天内形成球状体，5-7天后开始出芽。5-7天后类器官即可传代。经过1-2次传代后，类器官的典型生长特征应恢复正常。

 

D. 小鼠小肠类器官传代

1. 冰上解冻1管Matrix Gel。

2. 将类器官生长完全培养基（小鼠）预热至室温（15-25℃）。将含15 mM HEPES的DMEM/F-12保持在冰上。

3. 将24孔组织培养板在37℃培养箱中预热至少30分钟。

4. 轻柔移除每孔中的培养基。请勿扰动Matrix Gel的穹顶结构。

5. 每孔中加入1 mL 温和细胞解离试剂，覆盖暴露的穹顶结构。室温（15-25℃）孵育1分钟。

6. 使用预湿的1000 µL移液枪头，将孔内溶液上下吹打约20次以破坏穹顶结构并打散类器官。

7. 将悬液转移至15 mL离心管中。用额外的1 mL 温和细胞解离试剂冲洗孔内，并加入同一离心管中。

8. 对每个需要传代的孔重复步骤6-7。

9. 将含有类器官的15 mL离心管置于室温（15-25℃）摇床上，以20 rpm的速度孵育10分钟。

10. 在290 × g下离心5分钟，温度保持在2-8℃。轻轻倾倒并弃去上清液。

11. 使用预湿的移液管将沉淀重悬于10 mL预冷（2-8℃）的DMEM/F-12中。

12. 在200 × g下离心5分钟，温度保持在2-8℃。弃去上清液。

后续培养步骤请参考C部分。

E.a. 全标本免疫荧光染色

1. 移除培养基，并用DPBS洗涤含有小鼠肠道类器官的Matrix Gel三次。

2. 将类器官在4%多聚甲醛（PFA）中室温固定1小时。

3. 用DPBS洗涤类器官两次，每次至少15分钟。

4. 通过梯度甲醇在室温下透化3D细胞模型。依次用以下溶液洗涤类器官：DPBS洗涤两次；50%甲醇（溶于DPBS）洗涤一次；80%甲醇（溶于去离子水）洗涤一次；最后100%无水甲醇洗涤一次。

5. 依次用以下溶液洗涤类器官：20% DMSO/甲醇洗涤一次；80%甲醇（溶于去离子水）洗涤一次；50%甲醇（溶于DPBS）洗涤一次；100% DPBS洗涤一次；最后用含0.2% Triton X-100的DPBS洗涤一次。

6. 在37℃下用1% BSA（溶于0.1% DPBS-Tween）孵育1.5小时，以阻断非特异性蛋白相互作用。

7. 与一抗（E-cadherin，Abcam）在4℃下孵育过夜。

8. 与二抗（phalloidin，Thermo Fisher Scientific；DAPI，Thermo Fisher Scientific）在避光条件下孵育3小时。

9. 用DPBS洗涤样品三次，并进行共聚焦成像（Leica TCS SP8）。（图2）

E.b. 免疫细胞化学（ICC）染色

1. 移除培养基，并用DPBS洗涤含有小鼠肠道类器官的Matrix Gel三次。

2. 将类器官在4%多聚甲醛（溶于DPBS）中室温固定1小时。

3. 用DPBS洗涤孔板三次。

4. 向孔中加入含1%牛血清白蛋白（BSA，Sigma-Aldrich）的DPBS，并通过上下吹打破坏Matrix Gel的结构。将类器官及其碎片转移至1.5 mL离心管中。

5. 让类器官静置几分钟，或离心5-10秒以加速沉淀。弃去上清液，避免扰动类器官。

6. 加入30%蔗糖溶液，将类器官样品脱水过夜。

7. 将脱水后的类器官包埋于OCT化合物（Tissue-Tek）中，置于-80℃保存。

8. 对类器官样品进行8 µm的冷冻切片。

9. 用含0.1% Triton X-100的4%山羊血清（Thermo Fisher Scientific）对样品进行封闭和透化处理。

10. 将样品与下列6种一抗孵育过夜：Vimentin Cytoskeleton，Abcam；Lysozyme，Abcam；Chromogranin-A，Abcam；Mucin2，Abcam；Villin，Santa Cruz Biotechnology。

11. 与相应的二抗在避光条件下孵育3小时。

12. 用DPBS洗涤样品三次，并进行共聚焦成像（Leica TCS SP8）。（图3）

 

数据展示

 

图1. 在Matrix Gel中培养的小鼠小肠类器官。(A) 新鲜分离隐窝的原代培养图像（典型出芽与管腔形态）。(B) 三个批次基质中传代培养的类器官（Batch 1：第6代；Batch 2：第10代；Batch 3：第9代）。