体外表达重组蛋白质的系统对比

1170 人阅读发布时间：2022-03-07 10:07

蛋白质表达(protein expression) 是获得蛋白质的生物技术，利用人工合成的DNA或RNA从不同的宿主表达系统中取得目标蛋白质。
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♦ 体外表达重组蛋白质的系统包含四大类：
1.原核系统-大肠杆菌蛋白质表达
    原核生物中的大肠杆菌是目前最普遍的表达系统，具有遗传背景清楚、生长繁殖快、易于快速大量生产目标蛋白，所需的成本也相对较低。将欲表达外源基因的质体转型 (transform)至菌体，经培养放大细菌总量，以及诱导蛋白质表达后，可收集菌体经破菌与纯化流程，即可得到大量高纯度的蛋白。得到目标重组蛋白需要多层面的配合，包括挑选适合的菌种、质体、诱导以及蛋白质纯化方式。但原核表达系统的一大缺点在蛋白质分子的转译后修饰(post translational modification，PTM)及折叠等机构(machinery)在处理量能上，相较于真核与哺乳动物细胞粗陋，所以当外源性重组蛋白被大量诱导表达时，目标蛋白常被堆积在细胞质中成为包涵体(inclusion body)，包涵体内沉淀的蛋白质成变性状态(denature)，丧失原本的结构及功能，破菌收获后需目标蛋白的特性选用一系列工法将沉淀状态的目标蛋白团块溶解，再逐步地调整条件，使其重新正确折叠(refolding)，并恢复与对象结合、催化反应、组建复合体等功能性。
◊ 影响大肠杆菌表达系统产率主要有以下几项因素：
a.基因序列的优化 (gene optimization ):
根据表达的载体以及表达宿主系统的选择，需替换成宿主偏爱的密码子，以及调整序列中的GC含量来提升蛋白质的表达量与成功率。
b.表达载体的选择:
适用于蛋白质表达的质体种类繁多，原则上挑选高复本数(copy number)以及带有高度活化的启动子(promoter)为表达载体，目前主要有 pET系列、pGEX系列及pQE系列。应用最多的是pET系列，因其能在大肠杆菌中高效且高产表达蛋白，在诱发表达几小时后，目标蛋白产量可占总蛋白的50%以上。
c.合适表达蛋白质的菌种:
根据所使用表达载体的特点，目标基因密码子的组成等因素选择特定的表达宿主菌。目前最广泛被使用的菌株有：
-BL-21：缺乏内生性蛋白酶ompT, ompP, Lon protease，因此能防止产出之目标蛋白质被降解。
-BL21（DE3）：菌种染色体带有可受IPTG驱动表达之T7 polymerase，T7 polymerase为高活性之RNA polymerase，辨认质体上之T7 polymerase结合位置后可驱动表达外源目标蛋白。
-Rosetta：经过修饰，专门使用于带有大肠杆菌稀有密码子的真核蛋白表达的菌株，可提升真核基因表达效率。
2.真核系统-哺乳类细胞蛋白质表达
    哺乳类细胞具完整的蛋白质转译后修饰作用(PTM)，双硫键形成以及正确的蛋白分子摺叠功能，哺乳类细胞表达系统所产生的蛋白质更接近真实的蛋白质状态。一般最常用来表达的细胞有HEK293、CHO及NS0细胞，会使用哺乳类细胞表达系统来表达分泌型的蛋白质以及重组抗体的生成，可由细胞培养液中收集所表达的蛋白质或抗体进而执行纯化的步骤，但因为细胞培养的培养液费用较高，因此哺乳细胞表达系统的成本也较高，也较难建立稳定表达的细胞株。
3.真核系统-酵母菌蛋白质表达
    酵母菌是单细胞低等真核生物，其具有部分的蛋白质转译后修饰作用(PTM)，蛋白质的折叠也较大肠杆菌正确，并具有双硫键的形成能力。酵母菌可大规模生产，可降低生产成本。
4. 真核系统-昆虫细胞蛋白质表达
    昆虫细胞具有与大多数高等真核生物相似的蛋白质转译后修饰作用(PTM)，一般用来表达的细胞是草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda）sf9或sf21细胞，是利用杆状病毒在昆虫细胞中扩增目标蛋白，昆虫细胞适合高密度悬浮培养，也适用于分泌型蛋白表达。

重组蛋白表达系统比较

系统	原核	真核
类别	大肠杆菌	哺乳类细胞	酵母菌	昆虫细胞
优点	■ 成本低 ■ 快速 ■ 产量高	■ 可溶性蛋白表达 ■ 完整PTM，具完整生物活性 ■ 低内毒素 ■ 使用于分泌性蛋白表达	■ 成本低 ■ 快速 ■ 产量高 ■ 部分PTM，具部分生物活性	■ 可溶性蛋白表达 ■ 使用于分泌性蛋白表达 ■ 类似哺乳类细胞PTM
缺点	■ 较难表达大分子量蛋白 ■ Inclusion body生成 ■ 无PTM，无双流键，不确保生物活性 ■ 内毒素较高	■ 蛋白表达时间长 ■ 蛋白量相对较低 ■ 成本高	■ PTM修饰不完整	■ 蛋白表达时间长 ■ 成本较高 ■ 需使用大量的杆状病毒感染

♦ 为什么要使用重组蛋白
重组蛋白表达技术可研究基因调控，所表达的重组蛋白运用广泛，包含:
1. 生产抗体
2. 结构分析
3. 细胞疗法
4. 活性分析
5. 药物开发
6. 疫苗改良及开发
7. 检测试剂
8. 动物实验
9. 细胞实验
10. 保养品原料
♦ CHAMOT/乔默生物重组蛋白和竞厂的优势
1. 表达稳定
a. 原核细胞表达：以大肠杆菌为表达载体，表达不具转译后修饰的蛋白，已上架300多个产品。
b. 真核细胞表达：以HEK293细胞为表达载体，表达具转译后修饰的蛋白。
2. Antibiotic-free
3. Animal-free
4. 丰富的制备经验
具有完整且严谨的重组蛋白制造产线，目前已成功表达500多种不同种属，包括Human、Mouse、Swine等，皆为自主研发生产并优化，蛋白表达成功率高达90%。这些重组蛋白已成功的用于抗体制备、抗体药研发、诊断试剂 (ELISA、快筛)、疫苗研究等领域。
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5. 优化蛋白质冻干制程，于保存上更具优势
6. 严格的检验标准

a. 蛋白纯度高
- >98%，经HPLC分析验证
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b. 具生物活性
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c. 低内毒素
- <0.1 EU per μg of the protein by the LAL method

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