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乔默生物技术（上海）有限公司品牌商
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人 Th 细胞亚群分化方案
807 人阅读发布时间：2024-07-22 16:09
准备培养基：1640 培养基，胎牛血清，双抗，L- 谷氨酰胺，β- 巯基乙醇。
培养基配置：RPMI-1640 + 10% 胎牛血清 + 1mM L- 谷氨酰胺 + 55 μM β- 巯基乙醇+双抗。
准备细胞：分选出 Naive CD4+ T cells (CD4+CD25-CD44lowCD62Lhigh)。
细胞刺激培养：
1. CD3 包板：包板浓度 2 μg/ml（96 孔板加 50 μl，48 孔板加 200 μl）
加入上述体积后 4 度过夜包被，包被后弃去孔内液体，PBS 洗板 2 次。
2. 分选的 Naive CD4+ T cells 加入包被孔内，
加入上述体积后 4 度过夜包被，包被后弃去孔内液体，PBS 洗板 2 次。
2. 分选的 Naive CD4+ T cells 加入包被孔内，
- a) 96 孔板加入 1*105 细胞（200μl 培养体系）
- b) 48 孔板加入 2*105 细胞（500μl 培养体系）
根据需要分化的方向额外添加以下成分：
- a) Th1: IL-12 (50 ng/mL) plus anti-human IL-4 (10 µg/mL)
- b) Th2: IL-4 (50 ng/mL) plus anti-human IFN-γ (10 µg/mL)
- c) Th17: IL-6 (50 ng/mL), IL-1β (10 ng/mL), IL-23 (10 ng/mL), TGF-β1 (10 ng/mL) plus anti-human IFN-γ (10 µg/mL) and anti-human IL-4 (10 µg/mL)
- d) iTreg: TGF-β1 (10 ng/mL) plus anti-human IFN-γ (10 µg/mL) and anti-human IL-4 (10 µg/mL)
- e) Th9: IL-4 (50 ng/mL), TGF-β1 (10 ng/mL), plus anti-human IFN-γ (10 µg/mL)
- f) Th22: IL-6 (50ng/ml), IL-23 (50ng/ml), plus anti-human IFN-γ (10 µg/mL) and anti-human IL-4 (10 µg/mL)
- g) Tfh: IL-6 (50ng/ml), IL-21 (10ng/ml), CXCL13 (10ng/ml)
4. 细胞培养分化 3-5 天，培养过程中若培养液上清变黄，更换培养基，一般建议半量换液，根据培养经验，一般是隔天换液。
5. 培养分化后鉴定（胞内染色）：分化后的细胞加入20 ng/ml PMA , 1μg/ml Ionomycin 刺激 30 min 后，加入 10 μg/ml BFA 阻断，继续培养 3.5 h 后收集细胞进行流式检测。
6. 细胞鉴定：购买相应的流式抗体及辅助试剂进行胞内染色鉴定。
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