体外模拟 T 细胞激活与扩增：原理拆解与基础实操方法

T 细胞作为适应性免疫的 “核心战力”，其激活和扩增需精准调控，既要避免过度激活引发免疫损伤，也要确保数量和功能满足免疫应答或细胞治疗需求。

 

一、核心原理：精准模拟 “三信号激活机制”

T 细胞激活需满足 “双信号 + 细胞因子”三要素，缺一不可。

1. 第一信号（抗原特异性信号）
由 T 细胞受体（TCR）与抗原呈递细胞（APC，如树突状细胞）表面的 “MHC - 抗原肽复合物” 结合触发，负责识别 “外来入侵” 或 “异常细胞”（如肿瘤细胞），决定 T 细胞激活的特异性。体外激活扩增时常用抗 CD3 单克隆抗体替代 APC 表面的 “MHC - 抗原肽复合物”，直接与 T 细胞表面的 TCR-CD3 复合物结合，触发 T 细胞对抗原的特异性识别信号，这是激活的 “启动开关”。

2. 第二信号（共刺激信号）
T 细胞表面的共刺激分子（如 CD28）与 APC 表面的配体（如 B7-1/CD80、B7-2/CD86）结合，是 T 细胞 “完全激活” 的关键 —— 若仅有第一信号而无第二信号，T 细胞会进入 “免疫无能” 状态，无法增殖和发挥功能。

3. 第三信号（细胞因子信号）
激活后的 T 细胞需细胞因子（如 IL-2、IL-7、IL-15）提供 “增殖信号”，促进 T 细胞从 G0 期进入细胞周期，实现大量扩增，并维持其存活和功能（如分化为细胞毒性 T 细胞、记忆 T 细胞）。

 

二、常用实操方法

分 “非磁珠法” 和 “磁珠法” 两种方法核心都是提供 “双抗体 + 细胞因子”，但载体不同，效率和适用场景有差异：

非磁珠法（简易版，适合小规模实验）

• 原理：将抗 CD3、抗 CD28 抗体直接包被在培养板表面，模拟 “APC 与 T 细胞的接触式激活”。

• 步骤： 

1. 包被培养板：用无菌 PBS 稀释抗 CD3（1-5μg/mL）、抗 CD28（1-2μg/mL），加入培养板，4℃孵育过夜（或 37℃孵育 2 小时），弃去多余抗体，PBS 洗 1-2 次；

2.  接种细胞：分离人 / 小鼠外周血单核细胞（PBMC），或磁珠分选纯化的 CD3⁺T 细胞，按 1×10⁶细胞 /mL 密度接种到包被好的培养板中；

3. 加细胞因子：加入 IL-2（10-50 ng/mL，基础增殖因子），若需定向培养记忆 T 细胞，可加 IL-7（10 ng/mL）或 IL-15（10 ng/mL）；

4. 培养扩增：37℃、5% CO₂培养，每 2-3 天补加新鲜培养基和细胞因子（维持 IL-2 浓度），7-10 天可实现 10-50 倍扩增。  

• 优势：操作简单、无需特殊耗材，适合新手或小规模预实验；

• 不足：抗体固定在板上，T 细胞激活不均匀，扩增效率略低于磁珠法。  

 

磁珠法（高效版，适合大规模扩增）

• 原理：将抗 CD3、抗 CD28 抗体偶联在磁性微球表面（如 Dynabeads），磁珠可模拟 “APC 的立体结构”，与 T 细胞多方位接触，激活更高效、均匀。

• 步骤：

1. 准备磁珠：取抗 CD3/CD28 偶联磁珠，用无菌缓冲液（如 PBS+2% FBS）洗 2 次，按 “磁珠: T 细胞 = 1:1 或 2:1” 比例准备；

2. 混合孵育：将磁珠与纯化的 CD3⁺T 细胞（或 PBMC）混合，室温孵育 15-30 分钟，让磁珠与 T 细胞充分结合；

3. 加培养基与细胞因子：加入含 IL-2 的完全培养基（如 RPMI-1640+10% FBS），接种到培养瓶中；

4. 培养与磁珠分离：37℃、5% CO₂培养，每 2-3 天补液，扩增 5-7 天后，用磁铁分离磁珠（避免磁珠影响后续实验），继续培养至 10-14 天，可实现 50-100 倍扩增。  

• 优势：激活效率高、T 细胞功能均一，适合 CAR-T 制备、临床级 T 细胞扩增；

• 不足：需购买专用磁珠，成本较高。且后期回输前需去除beads。

 

*以上方案仅供参考，具体实验请根据情况做适当调整。

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