人诱导多能干细胞（hiPSCs）向破骨细胞的分化

破骨细胞的骨吸收功能缺陷可导致多种罕见遗传性骨病，以及骨质疏松症、骨硬化症等部分常见疾病。利用人诱导多能干细胞（hiPSC）分化获得的破骨细胞，为该研究领域开辟了新路径 —— 它能提供无限的细胞来源，并克服人体样本获取困难、缺乏合适动物模型等难题。

人诱导多能干细胞的建系技术已较为成熟，但将其高效分化为破骨细胞仍具有挑战性。已发表的 hiPSC - 破骨细胞分化方案多采用 hiPSC-OP9 共培养体系，或基于 hiPSC 来源的拟胚体（EB）联合多种细胞因子诱导。这里介绍一种三阶段分化方案，与其他方法相比，本方案无需共培养体系，可均一诱导拟胚体向中胚层分化，分化所需细胞因子更少，破骨细胞成熟时间更短，且能获得足够数量的破骨细胞用于后续分子生物学分析。

图 iPSC诱导为破骨细胞流程图

源自：Chen, I. (2020). Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) into Osteoclasts. Bio-protocol 10(24): e3854. DOI: 10.21769/BioProtoc.3854.

 

第一阶段：hiPSCs来源胚状体（EBs）的中胚层分化

培养时长：4天

核心目的：将hiPSCs解离为单细胞并形成均一大小EBs，诱导其向中胚层定向分化，为后续髓单核细胞生成奠定基础。

1. 筛选未分化的hiPSCs，用Accutase酶解离为单细胞，经PBS洗涤、340×g 4℃离心7分钟后，用含Stempro-34基础培养基、L-谷氨酰胺、MTG、hBMP4、hVEGF、Rock抑制剂Y-27632、抗坏血酸的EB中胚层分化培养基-1重悬，过70μm细胞筛并计数，以每孔15000个细胞接种于Nunclon Sphera 96孔板，37℃、5%CO₂+5%O₂培养2天，每孔形成单个均一EBs；

2. 培养第3天进行半量换液，弃75μl旧培养基，加入等体积含Stempro-34基础培养基、L-谷氨酰胺、MTG、2倍浓度hBMP4和hVEGF，以及hTPO、hFLT3-配体、hSCF、碱性hFGF、抗坏血酸的EB中胚层分化培养基-2，继续相同条件培养2天；

3. 培养1-4天期间，通过qPCR检测CDX2、CD34、Brachyury等中胚层标记基因的表达水平，验证中胚层分化效果。

第二阶段：髓单核细胞群的扩增

培养时长：21天

核心目的：将中胚层EBs诱导扩增为破骨细胞前体细胞（髓单核细胞），该细胞群高表达CD14、CD43、CD45表面标志物。

1. 收集第一阶段的EBs至离心管，重力沉降3-5分钟后弃上清，用含Advanced DMEM培养基、10%FBS、L-谷氨酰胺、NEAA、β-巯基乙醇、25 ng/ml hIL-3、50ng/ml hM-CSF的髓单核细胞扩增培养基重悬，按每孔40-50个EBs接种于明胶包被的6孔板，37℃、5%CO₂+5%O₂培养；

2. 培养第4天首次换液，更换为含100ng/ml hM-CSF的同配方髓单核细胞扩增培养基，后续每4天换液一次（第8、12、16天），维持相同培养条件；

3. 分别在培养第10、13、17、21天收集体系中的悬浮细胞，用含PBS、2%FBS、2mM EDTA的FACS缓冲液配制CD14、CD43、CD45抗体工作液，对细胞进行染色后流式检测，第17天为前体细胞最佳收集时间（标志物表达量最高且稳定性好）；

4. 收集该时间点的悬浮髓单核细胞，即为破骨细胞前体细胞，备用。

第三阶段：破骨细胞的成熟诱导

培养时长：7-14天

核心目的：将髓单核前体细胞诱导为具备骨吸收功能的成熟多核破骨细胞，从形态、染色、基因、功能多维度验证分化效果。

1. 收集第二阶段第17天的悬浮前体细胞，4℃、340×g离心7分钟，计数后按每孔10000个细胞的密度，同时接种于96孔板和铺有骨片的培养体系中；

2. 加入含α-MEM培养基、10%FBS、1α,25-二羟维生素D3、5 ng/ml hTGFβ-1、30 ng/ml hM-CSF、50 ng/ml hRANKL的破骨细胞分化培养基，37℃、5%CO₂培养，每2-3天更换一次新鲜的分化培养基；

3. 培养7-10天，倒置显微镜下观察细胞形态，可见多核成熟破骨细胞形成，完成形态学初步鉴定；

4. 培养10-12天，吸弃培养基用PBS轻洗，每孔加150μl 2.5%wuerquan室温固定10分钟，配制含蒸馏水、固红GBC、……、萘酚AS-BI磷酸溶液、乙酸溶液、酒石酸溶液的TRAP染色液，每孔加100μl染色液37℃孵育45分钟~1小时，弃液用蒸馏水冲洗晾干，显微镜下观察，紫红色大体积多核细胞为TRAP阳性成熟破骨细胞；

5. 培养14天，对骨片上的TRAP染色阳性细胞进行固定，通过扫描电镜观察骨片上的骨吸收陷窝，验证成熟破骨细胞的骨吸收功能；

6. 通过 qPCR 检测破骨细胞标志基因如hTRAP、hNFATc1、hCTSK、hCALCITONIN R的表达水平，以确认破骨细胞的分化状态。

 

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